O gene da calreticulina (CALR) codifica uma proteína que participa da regulação do cálcio intracelular. Mutações no éxon 9 do gene CALR são o segundo tipo de mutação somática mais comum em pacientes com as Síndromes Mielodisplásicas de Mielofibrose e Trombocitemia Essencial.

Sendo assim, este exame se aplica na investigação da suspeita de Trombocitemia Essencial e Mielofibrose Primária. É recomendado que antes de realizar este teste, seja avaliada a presença de alterações nos genes JAk2 e MPL.

Este teste consiste no sequenciamento da porção codificante do éxon 9 do gene CALR, assim como de suas regiões flanqueadoras.

A metodologia usada no exame é NGS- Sequenciamento de Segunda Geração por Multiplex.

O DNA é extraído de sangue periférico ou saliva de forma automatizada (QIASymphony). A técnica principal para o preparo da biblioteca de DNA é utilizando-se a tecnologia de PCR multiplexado com molecular barcode (QiaSeqDNA V3). Caso existam regiões não adequadamente cobertas na primeira técnica, é preparada por PCR convencional seguido de Nextera ou Sanger. O resultado final é uma cobertura de 100% das bases com profundidade acima de 50x nos exons e 5pb de região intrônica adjacente. A chamada de variante é feita através do transcrito de referência a partir da base A do códon de iniciação ATG alinhado contra o genoma de referência GRCh37/hg19.

- Este teste detecta pequenas deleções e duplicações até 17 bp, mas grandes deleções e duplicações não são detectadas por esta metodologia. Outras alterações estruturais,como inversões e translocações também não são detectadas. Havendo suspeita de algumas destas alterações, pode-se usar metodologias como array CGH, MLPA, qPCR ou FISH. - Mutações por expansão de repeats de trinucleotídeos não são detectáveis por sequenciamento. - Mutações intrônicas profundas ou em regiões regulatórias, como promotores, não são detectáveis no presente teste. - Alteração epigenéticas não são detectáveis por este teste.

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