A prova cruzada ou “cross-match" é empregada para avaliar se o receptor não é sensibilizado contra os Ag de histocompatibilidade do doador (ainda que seja seu primeiro transplante),o que deve resultar negativa. Esta avaliação é realizada através de um ensaio "in vitro" no qual uma amostra de soro do receptor é misturado com linfócitos do doador e incubados por um período. Após a incubação, durante a qual deve ocorrer a formação de complexo antígeno-anticorpo (se no soro houver a presença de anticorpos anti-HLA), adiciona-se ao sistema, uma fonte de complemento, que deverá provocar a lise de linfócitos reconhecidos pelos anticorpos. Na reação positiva, uma vez que existem anticorpos específicos anti-doador em circulação, se for realizado um transplante, este poderá ser rapidamente rejeitado. A reação de "cross-match" positiva pode ser observada em pacientes que foram submetidos a transfusões múltiplas, mulheres multíparas ou indivíduos que já foram previamente transplantados. Este exame também pode ser realizado com a finalidade de investigação de abortos de repetição.

A metodologia usada no exame é Linfotoxicidade dependente de complemento e/ou Citometria de fluxo.

A Prova Cruzada é uma técnica utilizada para determinar a existência de anticorpos anti HLA no soro do receptor direcionados contra os antígenos HLA expressos na membrana da célula do doador e pode ser realizada pela metodologia de Linfotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou pelo método de Citometria de fluxo.

Linfotoxicidade dependente de complemento (CDC): Em placas de Terasaki, o soro do receptor é incubado com linfócitos T e B do doador. Se existirem anticorpos pré-formados no soro, o anticorpo se unirá aos antígenos HLA expressos na superfície dos linfócitos do doador, formando o complexo antígeno-anticorpo. Após esta incubação, adiciona-se soro de coelho como fonte de complemento. O componente C1q do sistema complemento irá se ligar à porção Fc do anticorpo, e esta ligação inicia a cascata do complemento que resultará na lise da célula, o que será observado ao microscópio de imunofluorescência após a adição de corante. Nas reações positivas os linfócitos ficarão corados em vermelho e nas negativas ficarão corados em verde.

Citometria de fluxo: Os linfócitos T e B do doador são separados por seleção negativa utilizando a técnica RosseteSep e separação por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque e cruzados com o soro do receptor. É adicionado o reagente anti-IgG que irá se ligar onde houver ligação antígeno-anticorpo e emitir fluorescência, também é adicionado anti-CD3 (linfócitos T) e anti-CD19 (linfócitos B) que se ligam nos linfócitos possibilitando a diferenciação dos linfócitos T e B. Esta reação é analisa pelo Citômetro de Fluxo que gera dados brutos que são interpretados pelo setor de Histocompatibilidade. A reação positiva indica a presença de anticorpo anti-HLA doador específico e recomenda-se a busca de um novo doador.

A Prova Cruzada por Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) tem menor sensibilidade se comparada com a Prova Cruzada por Citometria de Fluxo.

• Prova cruzada Linfócitos T e B (doador)